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昆虫养殖

蜜蜂黑蜂王台病诊断技术规范

发布时间:2018-01-04 10:05:36 来源: 标签: 蜜蜂黑蜂王台病诊断技术规范
内容提要: 蜜蜂黑蜂王台病诊断技术规范1范围本规范规定了黑蜂王台病的诊断、疫情处理、预防等技术措施。本标准适用于辽宁省蜜蜂黑蜂王台病的防治。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引..

蜜蜂黑蜂王台病诊断技术规范

  • 1 范围

本规范规定了黑蜂王台病的诊断、疫情处理、预防等技术措施。

本标准适用于辽宁省蜜蜂黑蜂王台病的防治。

  • 2 规范性引用文件
  • 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修定单)适用于本文件。

GB3095环境空气质量标准

NY5027无公害食品 畜禽饮用水水质

NY 5139―2002无公害食品 蜜蜂饲养管理准则

NY5138 无公害食品 蜜蜂饲养兽药使用准则

DB21/T 1645-2008蜜蜂防疫技术规范

  • 3 术语和定义

下列术语和定义适用于本规范。

3.1 黑蜂王台病

黑蜂王台病是由黑蜂王台病毒引起的蜜蜂传染性病毒病。

3.2 蜂群

以群体为单位,由蜂王、工蜂、雄蜂组成的能独立生活的蜜蜂群体。

3.3 子脾

巢房内以卵、幼虫、封盖蛹为主的巢脾。

  • 4 诊断

依据本病流行病学特点、临床症状、病理变化、实验室检验等可做出判断。

4.1流行特点

在蜂王幼虫的巢房里,死亡的幼虫为黑色,其巢房也为深黑色,现在发现其蜂群常年易感染本病,成蜂和幼虫均可感染,染病的幼虫呈现灰黄色,然后呈囊状型,常年以隐性感染状态流行于蜂群中,只是春、秋季更加严重。

本病的主要传播途径是蜂群间通过蜜蜂的寄生性病原,如螨和微孢子虫,同一蜂群内,成蜂通过螨及微孢子虫,将病毒传染给健康蜜蜂及幼虫,导致幼虫及成蜂患病。

4.2 临床症状

黑蜂王台病主要感染45日龄幼虫,现在成蜂与幼虫均感染该病毒,且无明显的症状,只有感染该病毒的蜂王才可能会致死,大多死于封盖后期,而感染初期的幼虫为淡黄色,继而呈囊状型。体色由珍珠白变淡黄,继而变深黄、深黑。

4.3临床诊断

4.3.1箱外观察 正常情况下从工蜂体外并无异样,无明显的疾病症状;但是对于蜂王幼虫可见其黑或黑褐色。

4.3.2开箱检查 打开蜂箱,提出子脾,如果发现巢脾下边有王台,发现其颜色暗褐色,可初步确认。

4.3实验室诊断

4.3.1电镱检查 取病死幼虫,加等量0.03M磷酸缓冲液和1/4体积四氯化碳,研磨、匀浆。经超速离心机差速和蔗糖蜜度梯度离心提取,纯化。用提取物制备电镜片,置电镜下观察,有许多圆形病毒颗粒,可初步确诊为病毒,仍需进一步分析与鉴定。

4.3.2血淋巴诊断 应用免疫琼脂双扩散反应和对流免疫电泳法,进行抗原、抗体反应制备标准黑蜂王台病抗体和待检测病蜂血淋巴,取病虫组织液,经4000 rpm离心15min,取上清液为检测样品(抗原),若采用琼脂免疫扩散或对流免疫电泳关检测,若出现白色沉淀,即为阳性,感病;无沉淀线产生即为阴性,健康。

4.3.3 聚合酶链式反应扩增(RT-PCR

shishi.seanmacandrew.com Trizol试剂法

通过采集带有明显发黑或塌陷的王台病症状的蜂王幼虫或成蜂,将其病样溶于RNA提取试剂TRIzol中。

shishi.seanmacandrew.com 在上述小管中加入1mL Trizol 充分混匀,室温孵育5分钟;

shishi.seanmacandrew.com 12000 g4°C离心10min,小心吸出上清液加入新管中;

shishi.seanmacandrew.com 在上述1.5 mL小管中加入200 μL三氯甲烷,震荡小管15 s,管内液体变为粉红色,室温静置3 min

shishi.seanmacandrew.com 12000 g4 °C离心15 min,小心吸取上清液加入新管中;

shishi.seanmacandrew.com 在上述1.5 mL小管中加入500 μL异丙醇,上下颠倒混匀,室温静置10 min

shishi.seanmacandrew.com 12000 g4 °C离心10 min,弃去上清液,沉淀即为RNA

shishi.seanmacandrew.com 使用1mL 75%乙醇洗涤沉淀;

shishi.seanmacandrew.com 7500 g4 °C离心10 min,弃去上清液,干燥5-10 min

shishi.seanmacandrew.com 加入30 μL RNase-free water于上述离心管中,55 °C水浴5-10 min,直至RNA充分溶解;

shishi.seanmacandrew.com1.5 μL RNA溶液,使用NanoDrop测定浓度及质量,确保OD260/280都在1.8以上;

shishi.seanmacandrew.com50ul 无菌水,TE buffer0.5%SDS溶解RNA样品,贮存于-20℃备用。

shishi.seanmacandrew.com RT-PCR

根据反转录试剂盒的步骤,得到第一链cDNA。根据第一链及设计的相应引物,进行PCR扩增,其反应条件如下:首先94℃预变性3min;接着PCR进行30-35个循环,循环条件为94/30s,55/40s,72 /1 min;最后72 ℃延长10 min。扩增产物用1.2 琼脂糖凝胶电泳检查,当电泳产物出现与目标大小一致的条带,且唯一一条,而阴性样品无条带,则证实已检测到目标病毒。

5 疫情处理

根据流行病学特点、临床症状,结合实验室检测做出的诊断结果可作为疫情处理的依据。

5.1 发现疑似黑蜂王台病疫情时,养殖户应立即将病蜂王台毁掉,如果严重应立即更换新王。当地动物防疫监督机构要及时派员到现场进行调查核实,包括流行病学调查、临床症状检查、采集病料、实验室诊断等,根据诊断结果采取相应措施。

5.1.1隔离条件

发现有蜂群感染黑蜂王台病,应立即将病群隔离。同时对所有蜂群进行检查,根据检查结果分别处理。

5.1.2病群 将确诊患黑蜂王台病的蜂群转移到5公里以外,不易扩散病原体,便于消毒处理的地方隔离治疗,病群的蜂机具、蜂产品等未经处理,不得带回健康蜂场。

5.1.3疑似患病群

将疑似病群另外安置一远离健康群的场所,或更换新王,或隔离观察。

5.1.3假定健康群

将假定健康群于原地或另搬一场所进行观察。

5.1.4隔离解除

隔离的病群治愈后,经一个月的观察期再无复发,即可解除隔离。

5.2消毒

5.2.1消毒要求

病群、疑似病群和假定健康群都要进行消毒处理。消毒内容包括蜂机具、蜂脾、蜂体和工作服。

NY 5139―2002无公害食品 蜜蜂饲养管理准则有关规定进行。

5.3 扑杀,当蜂群发病严重,难以维持生存时,养殖者应将蜂群销毁,以防其传染。

5.4 无害化处理

对所有病死蜂采取焚烧后掩埋;对于被病蜂污染的蜂箱、巢脾等蜂机具可采用消毒方法进行处理。

6 黑蜂王台病的预防

6.1 蜂场环境

6.1.1 蜂场地势高燥、能满足蜂群摆放、背风向阳、安静、小气候良好。

6.1.2 蜂场周围空气质量符合GB3095空气质量功能区二类区要求。

6.1.3 水源充足,水质符合NY5027中幼畜禽的饮用水标准。

6.1.4 隔离条件 平原地区至少在半径 5 公里以上,山区至少在3公里以上无西方蜜蜂饲养场。

6.2 蜂场卫生要求

6.2.1 保持蜂场清洁,每周清理 1 次蜂场死蜂和杂草,清理的死蜂及时深埋;蜂场周围环境至少每季用5%的漂白粉乳剂喷洒或生石灰消毒一次。

6.2.2 蜂箱、隔板等每年至少消毒 1 次。巢脾、饲喂器、脱粉器、起刮刀、割蜜刀、蜂扫等工具在使用前、后要洗刷干净并消毒。工作服每周清洗消毒 1 次。

6.2.3 所选用的消毒剂必须对人、蜂安全,无残留毒性,对蜂机具无破坏性。

6.3蜂群管理

6.3.1 饲喂蜂群的蜂蜜、糖浆、花粉或花粉代用品要保证品质并经消毒灭菌处理。不用被蜜蜂病原体污染的饲料喂蜂。

6.3.2 不从疫区引进蜂种或到疫区放蜂。

6.3.3 在早春和晚秋繁殖期,加强蜂群保温,保持蜂脾相称或蜂多于脾。

6.4 药物预防

6.4.1 在整个繁殖和生产期之前,每个月用金银花等中草药预防一到三次。

6.4.2 在春、夏、秋三个季节,每个季度用抗病毒一号预防二次。

6.5 引种检疫

国内异地引入蜜蜂蜂群或蜂王,应取得原产地动物防疫监督机构的检疫合格证明。到达引入地后,种蜂必须隔离饲养一月以上,并由引入地动物防疫监督机构进行检测,合格后方可混群饲养。

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